汉中市疾病预防控制中心

1、采用主流二代测序平台。

2、核酸提取的技术方案和要求

  2.1 DNA 提取。核酸提取操作需符合试剂盒说明书的要求，提取后应进行质量测定。

  2.2 核酸质量控制要求。DNA提取物OD260/OD280在1.7~1.9之间，OD260/OD230大于2。无蛋白质污染。保持DNA的完整性。

3．高通量测序技术指标

  3.1 文库构建和测序方案。（1）根据自样品中提取的 DNA 量选择相应的建库试剂盒：起始总 DNA量在 10ng 以上采用普通建库试剂盒；总量在 100pg-10ng 之间，采用超微量 DNA建库试剂盒。（2）根据采用的测序系统的要求确定文库所需的片段化长度范围。根据不同建库试剂盒，可选用物理打断法或酶切打断法。

  3.2 文库质量控制。（1）浓度：采用核酸荧光检测仪检测文库的浓度，建库后浓度满足不同测序仪上机文库的最低浓度标准。（2）纯度：合格的文库DNA，其OD260/OD280在1.75~2.0之间。（3）片段长度：文库片段大小为插入片段和接头序列的总长度，合格文库插入片段长度符合所选测序读长的需求；文库主峰明显、无杂峰、无接头、无引物二聚体。

  3.3 测序及测序数据分析。利用高通量测序仪对构建的文库开展测序实验，采用测序读长≥100bp和双端测序模式。

  3.4 测序质量控制。

  3.4.1 全基因测序要求 （1）数据量：PE100 及以上测序，高质量测序数据（Q20）≥1Gb。最终获得的单菌高质量测序数据需为所测细菌种属基因组长度的 100X 或以上。（2）准确度：Q30 比例≥85%。（3）去接头后连续为N的读序不纳入分析。

  3.4.2 宏基因组测序要求 （1）数据量：PE150、PE250 及以上测序，rawdata数据量≥10Gb。（2）准确度：Q30以上占比≥85%,Q20以上占比≥90%。（3）去接头序列，去掉平均质量低于20的reads，去除连续含5个及以上的N的reads，去除宿主序列。（4）去宿主序列：包括人类基因组、线粒体等序列。（5）物种鉴定：参比数据库中需涵盖细菌、真菌、病毒、寄生虫等微生物，以微生物物种分类注释为目的。

4．基因组组装技术要求。质量要求：以测序分析的目标基因组作为参照，测定样品基因组覆盖度≥95%；整体覆盖度≥100X；Scaffold 个数小于 100 个。按各个单菌种分析并报告ST分型或血清型别并提供rawdata、Fasta文件等。宏基因组测序对下机原始数据进行质控、宿主数据过滤，提供数据分析结果报告（并满足国家CDC上报系统的数据质量要求）。鉴定结果包括中文病原体列表、病原体中文解释、病原体分类注释（致病菌、背景菌、微生态等）、预测耐药毒力基因对应病原等。（提供含中文列表的检测报告）

5、交付时间：单菌种从接收样品起10内完成并提供报告及rawdata、Fasta文件。宏基因组测序从接收样品起2周完成并提供报告及rawdata。

6、付款时间：合同执行完毕后，一次性结清（时间约2024年11月）。